Identifizierung von Tumorgewebe in dünnen pathologischen Proben mittels Femtosekundenlaser

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9250 (2023) Diesen Artikel zitieren

2 Altmetrisch

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Bei der Behandlung der meisten neu entdeckten soliden Krebstumoren bleibt die Operation die erste Behandlungsoption. Ein wichtiger Faktor für den Erfolg dieser Operationen ist die genaue Identifizierung onkologischer Sicherheitsabstände, um eine vollständige Entfernung des Tumors zu gewährleisten, ohne dass das benachbarte gesunde Gewebe stark beeinträchtigt wird. Hier berichten wir über die Möglichkeit, die laserinduzierte Femtosekunden-Breakdown-Spektroskopie (LIBS) in Kombination mit Algorithmen des maschinellen Lernens als alternative Unterscheidungstechnik zur Unterscheidung von Krebsgewebe einzusetzen. Die Emissionsspektren nach der Ablation an dünnen, fixierten postoperativen Leber- und Brustproben wurden mit hoher räumlicher Auflösung aufgezeichnet; Angrenzende gefärbte Abschnitte dienten als Referenz für die Gewebeidentifizierung durch klassische pathologische Analyse. In einem Proof-of-Prinzip-Test an Lebergewebe konnten künstliche neuronale Netze und Random-Forest-Algorithmen mit einer sehr hohen Klassifizierungsgenauigkeit von etwa 0,95 sowohl gesundes als auch Tumorgewebe unterscheiden. Die Fähigkeit, unbekanntes Gewebe zu identifizieren, wurde an Brustproben verschiedener Patientinnen durchgeführt, was ebenfalls ein hohes Maß an Unterscheidungsfähigkeit ermöglichte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LIBS mit Femtosekundenlasern eine Technik mit Potenzial für den Einsatz in klinischen Anwendungen zur schnellen Identifizierung des Gewebetyps im intraoperativen chirurgischen Bereich ist.

Die Operation ist nach wie vor der wichtigste Angriffspunkt zur Ausrottung von Krebserkrankungen, die im Frühstadium entdeckt werden. Die meisten neu diagnostizierten soliden Tumoren werden operativ entfernt, in der Hoffnung auf eine vollständige Heilung oder zumindest eine Verlängerung der Lebenserwartung des Patienten1. Nach der Operation verbleibende Krebszellen (z. B. durch positive Ränder der Resektionsprobe) können im Laufe der Zeit lokale Rezidive oder Metastasen erzeugen und sind einer der Schlüsselfaktoren für die Überlebensrate eines Patienten. In vielen Fällen sind anschließende chirurgische Eingriffe zur Entfernung des neu gebildeten neoplastischen Gewebes oder adjuvante Therapien (Strahlentherapie oder Chemotherapie) erforderlich, die viele Nebenwirkungen haben. Das Operationsergebnis wird vor allem durch die Erfahrung des Ärzteteams bei der Durchführung des onkologischen Eingriffs bestimmt: Ziel ist es, die bösartigen Zellen vollständig zu entfernen (um weitere Rückfälle zu verhindern) und so viel Gewebe wie möglich vom betroffenen Organ zu erhalten, ohne dessen Funktionalität zu beeinträchtigen. In der Praxis variieren die onkologischen Sicherheitsabstände je nach Krebsart und Tumorlokalisation zwischen 2 mm und 1 cm2. Für den Erfolg der Operation ist eine hochpräzise Lokalisierung des Tumors von entscheidender Bedeutung. Das Operationsteam kann auf die vor der Operation gewonnenen Informationen aus bildgebenden Verfahren (Magnetresonanztomographie, Röntgen-Computertomographie oder Ultraschall) zurückgreifen, im operativen Bereich basieren die Entscheidungen jedoch hauptsächlich auf visuellen und taktilen Informationen. Um zu entscheiden, ob das bösartige Gewebe vollständig entfernt wurde, wird oft die intraoperative pathologische Untersuchung an einer gefrorenen Probe durchgeführt. Dieser Eingriff dauert mehrere zehn Minuten und würde im Zweifelsfall die Operationszeit deutlich verlängern und das Risiko von Komplikationen erhöhen. Aus diesem Grund ist eine alternative oder ergänzende Technik mit einer schnellen und präzisen Bestimmung der Art des operierten Gewebes äußerst wünschenswert.

In den letzten Jahren wurden mehrere innovative Techniken für die In-vivo-Analyse untersucht. Massenspektroskopietechniken, bei denen Masse-/Ladungswerte für verschiedene Molekülfragmente gemessen werden, die aus der lokalen Zersetzung des Gewebes resultieren, wurden bereits in vivo getestet, um verschiedene Krebsarten zu identifizieren3,4,5. Parallel dazu wurden optische Techniken wie die optische Kohärenztomographie6,7, die Raman-Spektroskopie8,9,10 und die laserinduzierte Durchbruchspektroskopie (LIBS) aufgrund ihrer Portabilität und hohen räumlichen Präzision untersucht. Auch wenn die ersten Versuche, LIBS zur Erkennung von Krebsgewebe zu verwenden, fast zwei Jahrzehnte zurückliegen11, hat die Entwicklung von Algorithmen für maschinelles Lernen (ML) zur Interpretation einer großen Menge experimenteller Daten in den letzten Jahren diese Studien intensiviert12. Die LIBS-Technik analysiert die Emissionsspektren des Plasmas, das von auf die Oberfläche von Materialien fokussierten Lasern erzeugt wird. Der Vorteil besteht darin, dass bei einer Vielzahl von Proben schnelle Ergebnisse erzielt werden können, die keine komplizierte Vorbehandlung erfordern. Beim LIBS-Prozess wird das Material ionisiert und Plasma erzeugt, das beim Abkühlen spezifische Strahlung für die im Material vorhandenen chemischen Elemente emittiert. Viele Studien, die versuchen, verschiedene Arten von bösartigem Gewebe zu identifizieren, werden mit Nanosekundenlasern12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 durchgeführt, die Hochtemperaturplasma erzeugen und die Probe erheblich thermisch schädigen eine Abnahme der räumlichen Auflösung23. In früheren Studien haben wir gezeigt, dass Femtosekundenpulse (fs) für die präzise In-situ-/in-vivo-LIBS-Analyse von biologischem Gewebe23 und technischen Proben24 verwendet werden können, was eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von Mikrometern und unter 25 ermöglicht. Anwendungen von fs-LIBS zu verschiedenen biologischen Geweben werden in mehreren Studien vorgestellt (Ref.26 und Referenzen darin), ihre Verwendung bei der Erkennung von Krebsgewebe wurde jedoch weniger untersucht12,27,28,29.

In diesem Artikel werden unsere Ergebnisse zur Identifizierung von Leber- und Brustkrebs in pathologischen Standardproben des Menschen mithilfe von fs-LIBS- und ML-Algorithmen vorgestellt. Mithilfe der Vorteile ultrakurzer Laserpulse konnten wir atomare und molekulare Emissionsspektren nach der Ablation an sehr dünnen Proben mit einer Dicke von wenigen Mikrometern aufzeichnen. Die Art des Gewebes, aus dem das aufgezeichnete Spektrum stammt (das beim Training und der Bewertung von ML-Algorithmen verwendet wird), konnte durch direkten Vergleich mit den Ergebnissen der pathologischen Analyse benachbarter Schnitte identifiziert werden. Unseres Wissens wurde diese Art der Analyse an Proben mit mikrometrischer Dicke nur in einer kürzlich durchgeführten Studie an gastrointestinalem Tumorgewebe unter Verwendung von NS-Laserimpulsen durchgeführt22, aber die in dieser Veröffentlichung dargestellten Spektren weisen einen starken spektralen Beitrag des Substrats mit vielen Emissionen auf Linien, die sich mit denen des biologischen Gewebes überschneiden. Mit ultrakurzen Laserpulsen und einem hochreinen Quarzsubstrat führten wir eine Ablation mit hoher räumlicher Auflösung und geringem Kollateralschaden durch, und die aufgezeichneten Spektren enthalten nur Beiträge der Probe.

Die Arbeit ist wie folgt aufgebaut: Im nächsten Abschnitt werden der experimentelle Ablauf und Informationen zur Probenvorbereitung vorgestellt. Anschließend werden fs-LIBS und ML mit Lebergewebe getestet, um festzustellen, ob die aus sehr dünnen pathologischen Proben erhaltenen Spektren zur Identifizierung des Gewebetyps verwendet werden können. Außerdem wird in diesem Abschnitt die Reproduzierbarkeit der Messungen durch Vergleiche zwischen den an verschiedenen Tagen aufgezeichneten Daten untersucht. Im letzten Abschnitt werden die bei Brustkrebs erzielten Ergebnisse vorgestellt und wie die bereits an einigen Patienten trainierten Algorithmen verwendet werden können, um Krebszellen bei einer anderen Patientin zu erkennen.

Mit einem verstärkten Ti:Saphir-Lasersystem (Femtolasers, Femtopower Pro) wurden Laserpulse mit einer zeitlichen Breite von 30 fs bei einer Zentralwellenlänge von 785 nm und einer Wiederholrate von 1 kHz erzeugt. Durch den Einsatz der Pockels-Zelle (als elektrooptischer Impulswähler) im Verstärker wird die Wiederholungsrate auf einen Einzelschuss reduziert. Das linear polarisierte Licht wurde zu einem hochpräzisen selbstgebauten Impulsformer30,31 geleitet, wo die Gesamtdispersion der optischen Elemente bis zur Probenoberfläche mithilfe eines Zwei-Photonen-Fotodiodensignals als Rückkopplung kompensiert wurde. Zwischen dem Lasersystem und der Mikroskopplattform befinden sich mehrere optische Komponenten, um die Energie der Pulse zu variieren und aufzuzeichnen. Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm des in dieser Studie verwendeten fs-LIBS-Setups. Die Hauptkomponenten der Mikroskopplattform sind eine Überwachungskamera zur Probenpositionierung, ein schrittmotorgesteuerter XYZ-Translationstisch (PI miCos) und ein Neigungstisch, um die Oberfläche der Probe parallel zu den x- und y-Bewegungsrichtungen des Tisches auszurichten . Ein 10X Mitutoyo Plan Apo-Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,28 und einem Arbeitsabstand von 34 mm fokussiert die Laserimpulse auf einen gemessenen Strahlradius von 3,5 µm (bei \(1/{e}^{2}\) der Intensität). die Probe. Bei einem Rayleigh-Bereich unter 12 µm wird das Plasma auf der dünnen biologischen Probe erzeugt und erzeugt eine minimale Ablation vom Material des Substrats. Die Messungen wurden bei Raumtemperatur in Luftatmosphäre mit einer Energie pro Impuls von \(7\pm 0,5 \mu \mathrm{J}\) und einer entsprechenden Spitzenintensität von etwa \(5\times {10}^{14) durchgeführt }\mathrm{ W}/{\mathrm{cm}}^{2}\), was ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis mit sehr geringem spektralen Beitrag des Substrats gewährleistet.

Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus.

Für jede ausgewählte Stelle auf der Probe mit vorab identifiziertem Gewebetyp haben wir eine 10 × 10-Matrix in einem Einzelschussmodus des Lasers abgetragen; Nachdem das Spektrum des durch jeden Laserpuls erzeugten Plasmas aufgezeichnet wurde, wurde die Probe um einen Punkt-zu-Punkt-Abstand von 25 µm bewegt.

Das vom laserinduzierten Plasma emittierte Licht wurde mit einer NA von 0,22 durch ein System aus zwei Quarzglaslinsen gesammelt, die im 45°-Winkel nahe dem Mikroskopobjektiv positioniert waren, und durch eine optische Faser zum 50 µm großen Eintrittsspalt des Spektrometers transportiert (LOT). Oriel Multispec MS125). Für dieses Experiment verwendeten wir ein Gitter mit 400 Linien/mm und 500 nm Blaze (LOT Oriel 77417), das eine spektrale Auflösung von etwa 1 nm gewährleistete. Zur Aufzeichnung der Spektren wurde ein verstärkter PIMAX ICCD von Roper Scientific an das Spektrometer angeschlossen. Die Wellenlängenkalibrierung wurde mit einer Kalibrierlampe (LOT Oriel Pen Ray 6035 Hg(Ar)) ohne Intensitätskalibrierung durchgeführt.

Die Datenerfassung wurde mit dem Lasersystem synchronisiert. Der programmierbare Timing-Generator der Kamera steuert die Verzögerung und die Belichtungszeit (Gate) der Aufnahme mit Nanosekunden-Präzision. Für die fs-LIBS-Emission verwendeten wir eine Verzögerung von 23 ns nach dem Laserpuls und eine Gate-Zeit von 500 ns, um die Superkontinuumsemission des Laserpulses und den breitbandigen Hintergrund der Kontinuumsbremsstrahlung zu unterdrücken. Jedes Spektrum wurde gespeichert und entsprechend der Gewebeart beschriftet.

Untersucht wurden formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeproben menschlicher Leber mit einer Metastasierung von Darmkrebs, Brustgewebe mit Primärtumor sowie einem Lymphknoten mit metastasiertem Brustkrebs. Von jedem Paraffinblock wurden mit einem Mikrotom serielle 10 µm dünne Schnitte angefertigt und das Paraffin durch anschließendes Auflösen mit Xylol, Alkohol und Wasser gemäß Standardprotokollen entfernt32. Die äußersten Scheiben des Stapels wurden mit einem Standard-H&E-Protokoll (Hämatoxylin und Eosin) gefärbt, um Regionen mit gesundem und krebsartigem Gewebe zu identifizieren (Abb. 2a). Auf diese Weise wurde jeder Satz von zwei oder drei LIBS-Objektträgern durch ein Paar Referenzobjektträger gekapselt, und wir können die klassische pathologische Analyse durch optische Inspektion der gefärbten Außenschnitte nutzen, um mit hoher Sicherheit die entsprechenden Stellen auf den Innenschnitten für die Spektraluntersuchung auszuwählen. Die Scheiben mit Seitengrößen von etwa 2 × 1,5 cm wurden auf einen Objektträger gelegt. Bei der LIBS-Analyse an sehr dünnen Proben ist die Wahl des Substrats28 ein wichtiger Punkt, der starke Spektrallinien von Verunreinigungen aufweisen kann22. Aus diesem Grund haben wir uns für Substrate aus hochreinem Quarzglas (Plano GmbH) entschieden, bei denen im gemessenen Spektralbereich nur Emissionslinien von Silizium (Si) vorhanden sind, wie im Einschub in Abb. 3 zu sehen ist. As Da Silizium in den analysierten biologischen Geweben von Brust und Leber in vernachlässigbaren Mengen vorhanden ist33,34, haben wir Spektren mit signifikanten Si-Signalen entfernt, da diese nur vom Substrat stammen können. Eine andere Möglichkeit, Substratprobleme zu vermeiden (und höhere Signale zu erhalten), wären dickere Scheiben, die jedoch mit diesem Verfahren nur schwer zu erhalten und zu manipulieren sind.

Schematische Darstellung der Probenvorbereitung in (a) und Mikroskopiebilder der beiden Gewebetypen (Leber in (b) und Brust in (c)). Die roten Markierungen in (b) und (c) zeigen reine Tumorregionen an, während die blauen Markierungen reine, gesunde Regionen zeigen. Die übrigen Bereiche enthalten eine Mischung aus Tumor- und gesunden Zellen. Der Einschub in (b) zeigt das Bild einer abgetragenen Matrix, die dem entsprechenden Bereich im Referenzbild überlagert ist.

Vorverarbeitete (Basisliniensubtraktion und Vektornormalisierung) Leberspektren beider Klassen (rot = „Tumor“, blau = „gesund“), einschließlich der jeweiligen Signalverteilung jeder Wellenlänge innerhalb des Datensatzes, angezeigt durch die entsprechenden Farbschattierungen. Die Einfügung oben- Links zeigt einen Durchschnitt von 100 Spektren, die vom leeren Substrat (Quarz, grün) und Tumorlebergewebe (rot) aufgenommen wurden, und das Bild oben rechts zeigt einen vergrößerten Teil des Spektrums zur besseren Visualisierung der Na-Linie.

Tabelle 1 zeigt für jeden Patienten die Anzahl der LIBS-Proben und die Gesamtzahl der aufgezeichneten Spektren im Tumor- und gesunden Bereich. Bei den Proben von Patientin 3 handelt es sich ausschließlich um in Lymphknoten gewachsenes Brusttumorgewebe (kein gesundes Brustgewebe).

Abbildung 2 zeigt Bilder von zwei Referenzobjektträgern aus beiden Gewebearten (Leber und Brust). Tumorregionen werden durch eine dunkelviolette Farbe dargestellt (Abb. 2b und c, rot markierter Bereich), während gesunde Regionen durch eine hellere Farbe angezeigt werden (Abb. 2b und c, blau markierter Bereich). Spektralmessungen wurden auf die markierten Bereiche beschränkt, um die korrekte Identifizierung und Kennzeichnung des Gewebetyps sicherzustellen.

Die resultierenden Spektren werden zur späteren Analyse mit der entsprechenden Klasse („Tumor“ oder „Gesund“) gekennzeichnet. Um eine Verzerrung (während ML) aufgrund experimenteller Bedingungen zu vermeiden, wurde während jeder experimentellen Sitzung eine vergleichbare Anzahl von Spektren von jedem Gewebetyp aufgezeichnet. In unserem Ansatz ist die ML eine binäre Klassifikation und ihr Ziel ist es, gegebene Spektren in die Klassen „Tumor“ und „Gesund“ zu sortieren. Es muss erwähnt werden, dass eine Differenzierung der Tumorstadien bei der Auswertung nicht berücksichtigt wird. Auch die Klasse „Gesund“ berücksichtigt nicht den Gewebetyp oder die Zelltypen, sondern lediglich das Fehlen von Tumorzellen. Die Verarbeitung der Spektren und die Analyse durch ML-Algorithmen erfolgten über die Softwareanwendung für Data Mining, Orange Version 3.32.035.

Formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeproben menschlicher Leber, die eine Metastasierung von Darmkrebs, Brustgewebe mit Primärtumor sowie einen Lymphknoten mit metastasiertem Brustkrebs enthielten, wurden 2011 aus dem Archiv des Instituts für Pathologie Nordhessen (Deutschland) geborgen Einhaltung eines Votums der Ethikkommission für wissenschaftliche Forschung (bereitgestellt von der Hessischen Landesärztekammer, FF61/2014). Gemäß diesem genehmigten Votum verwenden wir nicht-vitale Gewebeproben, die mehr als 10 Jahre alt sind und überschüssiges Material enthalten, das nicht mehr von diagnostischer Relevanz ist. In solchen Fällen ist keine zusätzliche Einwilligung des Patienten erforderlich.

Im ersten Schritt beschränkt sich das Training und Testen des ML-Algorithmus auf die Spektren aus Leberproben. Sie umfassen große Bereiche von Tumoren und gesundem Gewebe und bieten eine hohe Sicherheit für die korrekte Identifizierung und Beschriftung der aufgezeichneten Spektren. Dies liefert eine Grundlage für die Leistung unserer vorgeschlagenen Methode, bevor die Analyse auf komplexere Fälle ausgeweitet wird.

Eine Reihe von Vorverarbeitungsschritten bereitete die erfassten Daten für die anschließende Analyse vor. Zunächst wurden ungeeignete Spektren mithilfe des Widgets „Lokaler Ausreißerfaktor“ in der Orange-Software aussortiert, das die lokale Abweichung eines bestimmten aufgezeichneten Spektrums in Bezug auf seine Nachbarn misst (wir verwendeten einen Kontaminationsfaktor von 5 % für 25 Nachbarn). Darüber hinaus deuten Spektren mit einer starken Si I-Spektrallinie bei 288,34 nm darauf hin, dass die Laserpulse auch das Quarzglassubstrat abgetragen haben und dass alle Spektren bei dieser Wellenlänge ein Signal enthielten, das höher als der Hintergrund war, sowie die maximalen zufälligen Rauschschwankungen für diesen Spektralbereich auch entfernt. Für die verbleibenden Daten wurden drei benachbarte Spektren gemittelt, wodurch der Datensatz effektiv um ein Drittel reduziert wurde. Basisliniensubtraktion und Vektornormalisierung der Spektren36 wurden angewendet, um geringfügige Abweichungen vom Aufnahmeprozess, wie z. B. Schwankungen in der Energie der Laserpulse, zu korrigieren. Der volle Bereich der nativen 1024 Pixel des ICCD wurde nicht genutzt, aber 30 davon an jedem Ende wurden aufgrund einer gewissen Vignettierung an den Ecken des CCD-Sensors entfernt. Schließlich enthielt der Leberdatensatz insgesamt 2392 gemittelte Spektren mit der Bezeichnung „Tumor“ und 2544 als „Gesund“ mit 964 Merkmalen (Pixel, die den Wellenlängen in den aufgezeichneten Spektren entsprechen).

Die für beide Klassen aufgezeichneten laserinduzierten Emissionsspektren sind in Abb. 3 dargestellt. Sie zeigen sowohl Atomlinien37 als auch Molekülbanden38. Die identifizierten Linien und Banden stimmen mit den Emissionsspektren biologischen Gewebes überein, die in anderen Veröffentlichungen dargestellt wurden15,16,38,39. Es ist erwähnenswert, dass im Fall von fs-LIBS die molekularen Emissionslinien stärker sind als im Fall von ns-Pulsen, wie auch andere Autoren betonten27,28, und dass die Natur dieser Banden in der Fragmentierung organischer Moleküle liegt nicht die Reaktion von Kohlenstoff mit Stickstoff in der umgebenden Laboratmosphäre, wie in Lit. 40 diskutiert. Die Ca II-Doppellinie bei 396,8 nm und 393,4 nm ist der einzige ionische Beitrag im Spektrum. Ein sichtbarer Unterschied in den Spektren (dargestellt in Abb. 3) zwischen den beiden Kategorien ist das Intensitätsverhältnis der Na-Linie, aber die Unterscheidung nur auf dieser Linie ist nicht so genau wie die Verwendung von ML-Algorithmen unter Berücksichtigung der vollständigen Spektralinformationen, die sie identifizieren können detaillierter und ermöglichen eine bessere Klassifizierung.

Die folgende Bewertung verschiedener ML-Algorithmen wurde mit dem Standard einer zehnfachen Kreuzvalidierung des Leberdatensatzes durchgeführt. Die Leistung der Algorithmen wird anhand ihrer Fähigkeit, jede Klasse einzeln zu erkennen, und dem Gesamtprozentsatz korrekter Entscheidungen, nämlich der Klassifizierungsgenauigkeit (CA), beurteilt.

Zur Analyse der Daten wurden mehrere Algorithmen mit unterschiedlicher Komplexität und Struktur ausgewählt: Naive Bayes, Entscheidungsbaum, Support Vector Machine, K-Nearest Neighbors, Random Forest und Neuronale Netze. Ihr CA-Score liegt über 0,85 und weist auf eine sehr gute Fähigkeit aller Modelle hin, die Gewebeklassen genau zu unterscheiden. Die drei wichtigsten Algorithmen, nämlich Artificial Neural Networks (ANN), Random Forest (RF) und K-Nearest Neighbor (KNN), wurden optimal an den Datensatz angepasst, indem ihre internen Parameter angepasst wurden, um den höchsten Prozentsatz an korrekter Klassifizierung zu erhalten. Für ANN verwendeten wir 512 Neuronen in einer verborgenen Schicht, 250 Bäume in RF und 25 Nachbarn für KNN. Die Ergebnisse der trainierten Algorithmen sind in Abb. 4 zusammengefasst, wobei die Balkendiagramme den Prozentsatz der korrekten Klassifizierung darstellen. Die ANN- und RF-Modelle können beide Klassen auf dem gleichen Niveau erkennen (mit einem CA-Score von ~ 0,95), während das KNN empfindlicher gegenüber Tumoren ist (CA-Score 0,88).

Prozentsätze korrekter Klassifizierungen mithilfe künstlicher neuronaler Netze, Random Forest und K-Nearest Neighbor für Tumor und gesundes Lebergewebe.

Die präsentierten Spektren weisen ausgeprägte Merkmale auf, was die Frage aufwirft, welche Merkmale (Wellenlängen) für die Entscheidungen des Algorithmus relevant sind. In diesem Abschnitt wird die Analyse der Spektrallinienbedeutung für die Unterscheidung gezeigt.

Ein einfacher Ansatz für diese Aufgabe besteht darin, einen Algorithmus so umzukehren, dass er die Klasse („Tumor“ oder „Gesund“) als Eingabe verwendet und ein „umgekehrtes Spektrum“ berechnet, bei dem die Intensität jeder Linie die Bedeutung beschreibt Entscheidung des Algorithmus. Der RF und seine entscheidungsbaumbasierte Struktur ermöglichen die Berechnung eines solchen „Umkehrspektrums“ über die mittlere Abnahme der Verunreinigung für alle Bäume (effektiv: Wie gut ist der Datensatz, der auf jede Klasse für jeden Baum und jede Wellenlänge abgebildet wird)41. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der Berechnung. Es ist zu erkennen, dass das „Umkehrspektrum“ den aufgezeichneten ähnelt, obwohl sich die Intensitäten der Spektrallinien deutlich unterscheiden. Die Natriumlinie hat erwartungsgemäß die größte Bedeutung für den Entscheidungsprozess des Algorithmus, da ihre unterschiedlichen Intensitäten in den aufgezeichneten Spektren beobachtet wurden. Der Anstieg der Na-Linienemission im Tumorgewebe wurde auch in anderen Veröffentlichungen diskutiert16,17 und wurde auf den intrazellulären Anstieg von Na zurückgeführt, der aus einer Änderung der Na+/H+-Kinetik in einer sauren extrazellulären Umgebung resultiert. Die C–N-Bande hat den zweithöchsten Wert und die zweithöchsten Intensitäten in den realen Spektren und zeigt zusammen mit den C–C-Banden die Bedeutung molekularer Signale für die Entscheidungsfindung. Es muss jedoch unbedingt erwähnt werden, dass diese Beobachtungen nur für das RF-Modell gelten und nicht unbedingt auf die anderen Modelle anwendbar sind. Dennoch gibt es Einblick in den Entscheidungsprozess und zeigt, dass die Algorithmen Spektrallinien zur Identifizierung der Klassen verwenden.

Das Umkehrspektrum (Wichtigkeitswert für jede Wellenlänge) des Random-Forest-Algorithmus überlappte mit den gemittelten aufgezeichneten Emissionsspektren für Lebertumoren.

Wir betonen, dass die Verwendung ultrakurzer Pulse in LIBS im Gegensatz zu ns-LIBS, wo die Differenzierung hauptsächlich auf atomaren und ionischen Linien basiert, auch die Verwendung molekularer Emissionsbanden in der Analyse ermöglicht. Die Reduzierung der Dimensionalität der Spektren42 durch die Verwendung verschiedener Kombinationen von Atomlinien oder Molekülbändern als Eingabe in ML erzeugt eine niedrigere CA als die Verwendung der gesamten Spektralinformationen (Ergebnisse sind nicht im Rahmen dieser Arbeit), daher wird sich unser Test auf bessere Klassifizierungen konzentrieren.

Nachdem die Fähigkeit der ML-Algorithmen zur genauen Identifizierung von Tumorgewebe beobachtet und nachgewiesen wurde, dass die Entscheidungsfindung auf Spektrallinien mit unterschiedlichem Bedeutungsgrad basiert, besteht der nächste Schritt darin, die Reproduzierbarkeit von fs-LIBS zu untersuchen und seine Anwendung als Analysewerkzeug zu prüfen . Die Ablationsprozesse sind komplex und empfindlich gegenüber verschiedenen externen Parametern. Diese Komplexität erhöht sich bei LIBS-Untersuchungen an biologischem Gewebe noch weiter, da dessen Elementzusammensetzung sehr heterogen ist. Um dieses Problem zu vermeiden, werden in vielen Studien breite Brennflecke zur Bestrahlung verwendet, wodurch die räumliche Auflösung verringert und die Kollateralschäden erhöht werden13,43,44,45, oder sie verwenden eine große Anzahl von Spektren zur Mittelung14,15,18. Fs-LIBS hat im Vergleich zu herkömmlichem ns-LIBS den Vorteil, reproduzierbarere Spektren aufzuzeichnen, da die Ionisation deterministisch ist und während des Laserpulses keine Laser-Plasma-Wechselwirkung auftritt. Der Aspekt der Reproduzierbarkeit und Konsistenz des Datensatzes wird im Folgenden angegangen: An derselben Lebergewebeprobe führten wir Messungen an drei verschiedenen Tagen durch, wobei wir den Aufbau für jeden Tag individuell optimierten. Daher sollten die Spektren idealerweise gleich sein, vorausgesetzt, dass jedes abgetragene Material innerhalb eines Gewebetyps dieselbe Elementzusammensetzung enthält. Folglich sollte das Training von ML-Algorithmen anhand der an einem Tag aufgezeichneten Spektren und das Testen an denen eines anderen Tages zu denselben Ergebnissen führen. Daher wurden die drei optimierten Modelle KNN, RF und ANN für alle möglichen Kombinationen der drei Tagesspektren-Teilmengen getestet. Alle diese Algorithmen zeigen eine gute Reproduzierbarkeit im Alltag, wobei die Prozentsätze der korrekten Klassifizierung über 75 % liegen. Im Folgenden werden wir die mit RF erzielten Ergebnisse diskutieren. Abbildung 6 zeigt die korrekten Vorhersagen für die Klassen „Tumor“ und „Gesund“ mithilfe des RF-Algorithmus.

Reproduzierbarkeit der Messungen am Lebergewebe. Prozentsatz korrekter Klassifizierungen, wenn der Random Forest-Algorithmus an einem Tag trainiert und anhand der an einem anderen Tag gemessenen Daten getestet wurde.

Die verschiedenen Balken zeigen eine sichtbare Abweichung der Leistung des Algorithmus an. Beispielsweise variiert die RF-Fähigkeit, Tumorgewebe zu erkennen, im Fall von „Train Day 1-Test Day 2“ im Vergleich zu „Train Day 1-Test Day 3“ um etwa 20 %. Allerdings sind Abweichungen zu erwarten, da viele Faktoren, B. leicht unterschiedliche Anpassungen des Aufbaus und die Inhomogenität des biologischen Gewebes, wirken sich auf die Leistung der Modelle aus. Darüber hinaus kann das Modell jede Klasse mit Prozentsätzen über 75 % und konsistenten CA-Werten (hier nicht gezeigt) über 0,88 genau identifizieren, was darauf hinweist Konsistenz innerhalb des Datensatzes.

Brustgewebe ist eines der heterogensten Gewebe46. In den von uns analysierten pathologischen Proben waren die Bereiche mit klarer Identifizierung des Tumors und des gesunden Gewebes kleiner als im Fall des Lebergewebes (wie in Abb. 2 zu sehen). Dies erschwerte den Messvorgang und erhöhte die Gefahr einer Fehlbeschriftung. Die Brustproben stammten von drei verschiedenen Patientinnen und ermöglichten uns somit, den Aspekt der Generalisierung im Vergleich zum Leberdatensatz zu untersuchen, der nur von einer Patientin stammte. Die Spektren von Brusttumor und gesundem Gewebe ähneln denen der Leber und sind in Abb. 7 dargestellt.

Vorverarbeitete (Basisliniensubtraktion und Vektornormalisierung) Brustspektren beider Klassen (rot = Tumor, blau = gesund), einschließlich der jeweiligen Signalverteilung jeder Wellenlänge innerhalb des Datensatzes (farbige Schatten). Der Einschub oben rechts zeigt einen vergrößerten Teil des Spektrums zur besseren Visualisierung der Na-Linie.

Die Zuordnung der Spektrallinien und -bänder sowie die Vorverarbeitung, Modellauswahl und Feinabstimmung erfolgten analog zum Leberdatensatz. Die drei optimierten Modelle (KNN, RF und ANN) erbringen eine sehr hohe Leistung mit konsistenten CA-Werten über 0,85 (KNN = 0,85, RF = 0,92 und ANN = 0,91), wenn der gesamte Spektrensatz für die drei Patienten analysiert wird.

Im Sinne einer Generalisierung haben wir die Fähigkeit der Algorithmen getestet, neue Daten von unbekannten Patienten korrekt zu klassifizieren. Im Rahmen dieses Projekts verwendeten wir den Datensatz der beiden Patienten mit Primärtumoren für den Trainingsprozess und testeten die Fähigkeit der Algorithmen, den Metastasentumor am dritten Patienten zu identifizieren. Der Trainingspool bestand aus Spektren beider Klassen, während der Testsatz nur Tumorgewebespektren enthielt. Für die Trainingsphase verwendeten wir Spektren von 1985 Tumoren und 2558 Gesunden, während der Test am neuen Patienten mit 1590 Tumorspektren durchgeführt wurde. Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse der korrekten Klassifizierungen der drei Modelle.

Prozentsätze korrekter Klassifizierungen von Metastasen, wenn die Algorithmen an Primärtumoren anderer Patienten trainiert wurden.

Der Prozentsatz von 99,9 (KNN und RF) und 99,7 (ANN) weist eine überraschend hervorragende Vorhersagerate auf und deutet auf die Möglichkeit einer Verallgemeinerung hin. Da der Trainingspool jedoch aus zwei Patientinnen und der Testpool aus einer Patientin mit Brustkrebszellen in Lymphknoten bestand, ist für eindeutigere Schlussfolgerungen ein größerer Patientenpool erforderlich.

Es wurde gezeigt, dass fs-LIBS mit sehr dünnen Proben auf einem Quarzglassubstrat verwendet werden kann und dass das erzeugte Signal stark genug ist, um tumoröses von gesundem Lebergewebe mit hoher räumlicher Auflösung zu unterscheiden. Mithilfe einer Mischung aus benachbarten mikrotomgeschnittenen LIBS- und Referenzschnitten haben wir den Gewebetyp korrekt identifiziert. Die Algorithmen „Random Forest“ und „Artificial Neural Networks“ schnitten am besten ab und klassifizierten in mehr als 94 % der Fälle sowohl Tumor- als auch gesundes Lebergewebe korrekt. In diesem Fall lieferte der K-Nearest Neighbor-Algorithmus eine hervorragende Identifizierung von Tumorgewebe, erzielte jedoch bei gesundem Gewebe mäßige Ergebnisse. Mithilfe des RF-Algorithmus wurde die Merkmalsbedeutung berechnet, was zu der Schlussfolgerung führte, dass molekulare Banden und Natriumlinien im Entscheidungsprozess Vorrang haben. Das Vorhandensein der Moleküllinien stellt einen der Vorteile des Einsatzes ultrakurzer Laser dar, die nach der Ablation mit niederenergetischen Pulsen eine gute spektrale Signatur erzeugen. Dies vermeidet eine massive Dissoziation des molekularbiologischen Materials wie im Fall von NS-Laserpulsen, bei denen die Unterscheidung des Gewebetyps nur auf den atomaren oder ionischen Linien basiert20,22,43. Die Möglichkeit, diese Technik bei einer neuen, unbekannten Patientin anzuwenden, wurde an Brustproben mit sehr guter Klassifizierungsgenauigkeit untersucht.

Zukünftig wollen wir neben der Erhöhung der Patientenzahl und der Untersuchung des Einflusses der Probenvorbereitung auch die Pulslängenabhängigkeit für die Gewebedifferenzierung untersuchen. Um die Identifikationsgenauigkeit weiter zu erhöhen, werden neben der Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses durch die Verwendung doppelt zeitverzögerter Femtosekundenpulse25 komplexere numerische Algorithmen47 eingesetzt. Mögliche Anwendungen im intraoperativen Bereich sollten die Verfügbarkeit von Laserquellen berücksichtigen, wo Faserlaser mit hoher Wiederholrate und längerer Pulsdauer vielversprechend zu sein scheinen48 und auch leicht in endoskopische Geräte integriert werden können.

Wir gehen davon aus, dass diese Methode in situ/in vivo als ergänzende Methode zur standardmäßigen pathologischen Analyse eingesetzt werden kann.

Angesichts der räumlichen Genauigkeit der Ablation mit Femtosekunden-Laserpulsen und des geringen erforderlichen Probenvolumens glauben wir, dass intrachirurgische Informationen über die Art und das Ausmaß des Tumors gewonnen werden könnten, nachdem die Identifizierungsalgorithmen an Biopsieproben desselben Patienten trainiert wurden. In ferner Zukunft, wenn FS-Laser als chirurgische Instrumente eingesetzt werden könnten, könnte diese Methode dabei helfen, gesundes von krankem Gewebe direkt während der Inzision zu unterscheiden.

Die Datensätze während und/oder analysiert während der aktuellen Studie sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Sabrina Schuster, Andreea Cojocaru, Arne Ungeheur und Dr. Vladimir Gross von der Universität Kassel für die Hilfe bei der Verbesserung des Versuchsaufbaus und der Analysemethoden. PD Dr. med. Kia Homayounfar vom Klinikum Kassel, Dr. med. Hannah Fahrner und Dr. rer. nat. Wir danken Matthias Fahrner von der Universität Freiburg für hilfreiche Diskussionen.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Die Autoren erklären, dass keine Drittmittel in Anspruch genommen wurden.

Institut für Physik, Universität Kassel, Heinrich-Plett-Str. 40, 34132, Kassel, Germany

Cristian Sarpe, Elena Ramela Ciobotea, Christoph Burghard Morscher, Bastian Zielinski, Hendrike Braun, Arne Senftleben & Thomas Baumert

Institut für Pathologie Nordhessen, Germaniastr. 7, 34119, Kassel, Germany

Josef Rüschoff

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CS, ERC und CBM führten die Messungen durch und verfassten das Manuskript; ERC, CBM und BZ analysierten die Daten. Alle Autoren beteiligten sich mit kritischen Diskussionen, lasen und genehmigten das Manuskript.

Korrespondenz mit Thomas Baumert.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sarpe, C., Ciobotea, ER, Morscher, CB et al. Identifizierung von Tumorgewebe in dünnen pathologischen Proben mittels Femtosekundenlaser-induzierter Abbauspektroskopie und maschinellem Lernen. Sci Rep 13, 9250 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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Eingegangen: 23. Januar 2023

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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